免疫组化染色实验步骤

免疫组织化学技术(IHC) 现在发展的已经很成熟了，应用范围也比较广泛，涉及到各个学科，也是临床医学专业的需要掌握的基础技术之一。免疫组化是应用抗原和抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂显色来确定组织细胞内抗原，对其进行定位、定性及定量的研究。是临床病理诊断与科学研究中必不可少的一种方法，其中石蜡组织的免疫组化染色是最常用的技术。

一、 脱蜡和水化  

Note！脱蜡前将组织芯片放在60℃恒温箱中烘烤2~3小时  

1) 置于二甲苯I中浸泡10分钟，在二甲苯II中浸泡10分钟，在二甲苯III中浸泡10分钟，在二甲苯Ⅳ中浸泡10分钟；  

2) 无水乙醇I中浸泡5分钟在无水乙醇II中再浸泡5分钟； 

3) 95%乙醇中浸泡5分钟； 

4) 85%乙醇中浸泡5分钟；  

5) 70%乙醇中浸泡5分钟； 

6) 蒸馏水中浸泡5分钟；

抗原热修复 

A、高温高压热修复 (酸性修复条件为例)

取一定量的0.01M柠檬酸盐缓冲液pH6.0于压力锅中大火加热至沸腾，将脱蜡水化后的组织芯片置于耐高温塑料切片架上，放入已沸腾的缓冲液中，盖上锅盖扣上压力阀继续加热至喷气，从喷气开始计时1-2分钟后压力锅离开热源，冷却至室温，取出玻片，先用蒸馏水洗两次后，用PBS洗5分钟。 

B、微波热修复   (酸性修复条件为例)

取一定量的0.01M柠檬酸盐缓冲液pH6.0于微波盒中微波加热至沸腾，将脱蜡水化后的组织芯片置于耐高温塑料切片架上，放入已沸腾的缓冲液中中，高档继续处理10-15分钟，取出微波盒冷却至室温，取出玻片先用蒸馏水洗两次，后用PBS洗5分钟。

酶消化方法

常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶，使用前酶预热至37℃，切片也预热至37℃，消化时间为10-30分钟

二、免疫组化（IHC）染色

1) 脱蜡水化；

2) PBS洗3次，各6分钟； 

3) 抗原修复；

4) 用蒸馏水配置新鲜的3%H2O2-甲醇室温封闭10分钟；  

5) PBS洗3次，各6分钟； 

6) 滴加正常山羊血清封闭液,室温20分钟； 

7) 甩去多余液体滴加一抗4℃过夜；

8) 37℃复温45分钟； 

9) PBS洗3次，各8分钟；

10) 滴加二抗，室温30分钟；

11) PBS洗3次，各8分钟； 

12) DAB显色10分钟在显微镜下掌握染色程度； 

13) 蒸馏水洗终止染色；

14) 苏木素复染，盐酸酒精分化； 

15) 脱水透明封片镜检；

主要事项：

Note! 上述冲洗步骤切勿直接对着组织冲洗，冲洗时力度要适中，以免组织芯片掉片。